|
|
Rekombinantní příprava receptorů potkaních NK buněk v expresním systému HEK293T.
Celadová, Petra ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent)
NK buňky hrají důležitou roli v imunitní odpovědi proti nádorovým a virově infikovaným buňkám. Exprimují široké spektrum různých povrchových receptorů, mezi které patří také NKRP1. Jedná se o rodinu C-lektinových receptorů, která zahrnuje receptory jak s inhibiční, tak s aktivační funkcí. Poměrně nedávno byly pro některé molekuly z této rodiny nalezeny ligandy, které patří taktéž do nadrodiny C-lektinových receptorů . Jedná se mj. o potkaní Clr-b, fyziologický ligand pro NKRP1B. Bylo zjištěno, že inhibiční funkce receptorového komplexu NKRP1B-Clr-b může být nabourána proteinem potkaního cytomegaloviru RCTL, virové verze Clr-b, která slouží jako falešný ligand pro NK buňky. Cílem mé diplomové práce bylo klonování a příprava zmíněných C-lektinových receptorů v transientně transfekované HEK293T buněčné linii v suspenzní kultuře. Tento expresní systém umožňuje získat proteiny s uspokojivým výsledkem, a to v jejich nativní konformaci, čímž je odstraněna potřeba časově náročných a často bezvýsledných pokusů o renaturaci proteinů připravených pomocí bakteriálního expresního systému v E. coli. Úspěchu bylo dosaženo v případě Clr-b a NKRP1B receptorů potkaních kmenů WAG i SD. Proteiny byly purifikovány za pomoci chelatační chromatografie následované gelovou filtrací, identifikovány hmotnostní spektrometrií a...
|
|
|
Studium struktury receptoru DCL-1 pomocí hmotnostní spektrometrie
Růžičková, Barbora ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Mrázek, Hynek (oponent)
DCL-1 (CD302) je transmembránový C-lektinový receptor typu I, který je exprimován na monocytech, makrofázích, granulocytech a dendritických buňkách. Jeho extracelulární doména však postrádá aminokyselinové motivy, esenciální pro vazbu sacharidových struktur v přítomnosti vápenatých kationtů, což naznačuje, že nemá klasickou vazebnou aktivitu typickou pro C-lektinové receptory jako například manosový receptor. Žádné jeho exogenní nebo endogenní ligandy ovšem nebyly dosud nalezeny. V důsledku vnitřní kolokalizace s F-aktinem lze předpokládat, že tento nekonvenční lektinový receptor hraje důležitou roli nejen v endocytóze a fagocytóze, ale také v buněčné adhezi a migraci. Receptor DCL-1 byl poprvé identifikován jako genetický fúzní partner lidského multilektinového receptoru DEC-205 v buněčné linii Hodgkinova lymfomu. Experimentální část této práce se zabývá identifikací zapojení disulfidických vazeb a získání dat k validaci krystalové struktury DCL-1. Nejprve byla provedena optimalizace podmínek produkce a renaturace za účelem získat co největší množství proteinu DCL-1, resp. jeho extracelulární domény. Optimální podmínky byly využity k přípravě proteinu, se kterým bylo provedeno štěpení v gelu specifickými endopeptidasami za přítomnosti cystaminu následované LC-MS analýzou. Porovnáním naměřených dat z LC-MS...
|
|
|
Rekombinantní příprava receptorů potkaních NK buněk v expresním systému HEK293T.
Celadová, Petra ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent)
NK buňky hrají důležitou roli v imunitní odpovědi proti nádorovým a virově infikovaným buňkám. Exprimují široké spektrum různých povrchových receptorů, mezi které patří také NKRP1. Jedná se o rodinu C-lektinových receptorů, která zahrnuje receptory jak s inhibiční, tak s aktivační funkcí. Poměrně nedávno byly pro některé molekuly z této rodiny nalezeny ligandy, které patří taktéž do nadrodiny C-lektinových receptorů . Jedná se mj. o potkaní Clr-b, fyziologický ligand pro NKRP1B. Bylo zjištěno, že inhibiční funkce receptorového komplexu NKRP1B-Clr-b může být nabourána proteinem potkaního cytomegaloviru RCTL, virové verze Clr-b, která slouží jako falešný ligand pro NK buňky. Cílem mé diplomové práce bylo klonování a příprava zmíněných C-lektinových receptorů v transientně transfekované HEK293T buněčné linii v suspenzní kultuře. Tento expresní systém umožňuje získat proteiny s uspokojivým výsledkem, a to v jejich nativní konformaci, čímž je odstraněna potřeba časově náročných a často bezvýsledných pokusů o renaturaci proteinů připravených pomocí bakteriálního expresního systému v E. coli. Úspěchu bylo dosaženo v případě Clr-b a NKRP1B receptorů potkaních kmenů WAG i SD. Proteiny byly purifikovány za pomoci chelatační chromatografie následované gelovou filtrací, identifikovány hmotnostní spektrometrií a...
|
host ::
RSS.